PKCのトランスロケーションの観察（得田久敬　平成15年度卒業論文より）

【１】トランスフェクション

フラスコに80%コンフルエントのCHO-K1細胞を得ておく。培地を除き，PBS (5 mL) で洗った後，細胞を剥がすためにトリプシン (1 mL) を加え，すぐにこれを除去し5分間37℃にてインキュベートした。フラスコの中のCHO-K1細胞をF12-10%FBS培地で懸濁し，血球計数板を用いて細胞の濃度を調べた。濃度が6.0×104個／mLになるようにF12-10%FBS培地で希釈し，これを24ウェルプレートに500 μLずつ加え，24時間37℃でインキュベーターで培養した。 　トランスフェクションはεPKC-GFP融合タンパク質が組み込まれたpTB701プラスミドをリポフェクトアミン法を用いて行うことにした。TE bufferで溶かしてあるpTB701 (0.5 mg／mL) 1.6μLを50 μLのOpti-MEM (serum free) で希釈し，ピペッティングにて穏やかに攪拌した。次に0.5 μLのLipofectamine 2000 (Invitrogen) を50 μLのOpti-MEM で希釈し，ピペッティングにて穏やかに攪拌した。２つのサンプルを５分間室温でインキュベートした後，これらを混合し，ピペッティングした。さらにこの混合液を20分間室温でインキュベートし，トランスフェクション誘導体を得た。 あらかじめ作っておいた24ウェルプレートのウェルに100 μLのトランスフェクション誘導体を加え，縦横左右に揺すって混合させた。その後48時間37℃でインキュベートした。

【２】トランスロケーションを起こすのに必要なdiC8濃度の閾値の決定

10.0 mgの diC8を2.91 mLのDMSOで希釈し，10-2 MのdiC8DMSO溶液を作った。これをさらにDMSOで希釈し，サンプル負荷時における終濃度の100倍になるようなdiC8溶液を調製した。この時のdiC8の濃度 [diC8] と調製法をTableにまとめた。続いて， 調製した各濃度のdiC8溶液 5 μLをOpti-MEM 195 μLで希釈し，200 μLのトランスロケーション用サンプルを作成した。 ウェルから培地を除き，PBS (500 μL) で洗った後にOpti-MEM (300 μL) を加えた。ここに200 μLのトランスロケーション用diC8溶液サンプル を加えた。細胞への負荷時におけるdiC8の終濃度もTable に示した。
その後，蛍光顕微鏡でGFPの蛍光を観察した。 5秒間毎に画像を取り込み，サンプル負荷後10分間観察を続けた。

【３】トランスロケーションの光制御

論文準備中

参考文献