ケージドcAMPでメダカ黒色素胞の色素顆粒の運動を光制御する

１．野生メダカの背部よりウロコをはがし，Ca2+, Mg2+-Free Ringer Solutionの入ったシャーレに浸けて4℃で20分間静置する。ピンセットで表皮層を剥離した後，ケージドcAMP溶液またはリンガー溶液の入った別 のシャーレに入れて，室温で１時間インキュベートする。

２．ウロコをホルダーにセットして，蛍光顕微鏡下でリンガー溶液を灌流する（?? mL/minぐらい）。明視野で観察すると，色素顆粒はほぼ完全に拡散しているはず。この状態の写 真を撮影して（写真A），100%拡散とする。

３．0.5 mMのノルエピネフリン溶液を２分間灌流すると，黒色素胞は凝集状態になるので，ここで写 真を撮影して（写真B）0%拡散とする。

４．蛍光励起用の光源にU-励起フィルター（330 - 385 nmを透過するバンドパスフィルター）を入れて，適当な時間（Bhc-cAMP/Acの場合は10秒間）UV光を照射する。その30秒後に写 真を撮影する（写真C）。

５．内因性のPDEの作用でcAMPがAMPへと加水分解されるので，色素顆粒は徐々に凝集しはじめる。30-60秒後には完全に凝集するので，UV照射を繰り返すことで，顆粒の拡散と凝集を最低５-６回は繰り返すことが出来る。

６．撮影した写真を画像解析ソフト（例えばNIH Image）で解析し，黒色素胞内の色素顆粒が占める割合を算出する。一定の面 積で囲まれた領域内の黒い部分の面積を出せばよい。（写真C − 写真B）x 100／（写 真A − 写真B）をケージドcAMPの光照射による色素顆粒の拡散率（％）とする。

参考文献

T. Furuta, H. Takeuchi, M. Isozaki, Y. Takahashi, M. Sugimoto, M. Kanehara, T. Watanabe, K. Noguchi, T. M. Dore, T. Kurahashi, M. Iwamura, R. Y. Tsien, Bhc-cNMPs as either water-soluble or membrane-permeant photo-releasable cyclic nucleotides for both one and two-photon excitations, ChemBioChem, in press.

T. Furuta and M. Iwamura, New Caged Groups: 7-Substituted coumarinylmethyl Phosphate Esters, Methods in Enzymology, 291, 50-63 (1998) [PubMed]

T. Furuta, A. Momotake, M. Sugimoto, M. Hatayama, H. Torigai and M. Iwamura, Acyloxycoumarinylmethyl-Caged cAMP, the Photolabile and Membrane-ermeable Derivative of cAMP That Effectively Stimulates Pigment-Dispersion Response of Melanophores, Biochem. Biophys. Res. Commun. 228, 193-198, (1996) [PubMed]

T. Furuta, H. Torigai, M. Sugimoto and M. Iwamura, Photochemical Properties of New Photolabile cAMP Derivatives in a Physiological Saline Solution. J. Org. Chem. 60, 3953-3956, (1995)