GFPとDsRedの蛍光比からRNAiの効果を見積もる 

トランスフェクション

(1) トランスフェクションを行う24時間前に，24穴プレートに1 wellあたり3×104 個のHeLa細胞をまく(1 wellあたり10 % FBS/DMEM 500 uL)。
(2) 20 uM siRNAを200 nMに希釈する。 20 uM siRNA 0.2 uLをバッファー 19.8 uLに加えてピペッティングする (A)。
(3) Opti−MEM 90 uLに1714 ug/mLのpEGFP 0.36 uL (617 ng)，1643 ug/uLのpDsRed　(985 ng)、 (A)のsiRNA 0.2 uL (62.6 pg)を加え(※)，ピペッティングした後，15分静置 。
(※) siRNAはpEGFPをターゲットにしている 　( siRNAを加えればEGFPは発現せず、siRNAを加えないとEGFPは発現する 　 DsRedの発現に影響は無い)
(4) Opti−MEM 9.2 uLにリポフェクトアミン2000 0.8 uLを加え，よくピペッティングした後，10分静置 。
(5) (3)と(4)をピペッティングにより混合し，20分静置
(6) (5) の待ち時間で24穴プレートの培地を交換しておく。 古い培地を除去してからPBS(−)で洗う。PBS(−)を除去してから，1 wellあたり10 % FBS/DMEMを 500 uL加える 。
(7) (6) のプレートに (5) を加え，37 ℃ CO2インキュベーターで24時間カルチャー する。

顕微鏡観察

(8) 用いる蛍光顕微鏡はオリンパスIX-71。対物レンズはX10の〜。観察用光源，ケージ解除用光源（アンケージングする場合），CCDカメラおよびシャッターコントローラーの電源を入れてから，PCの電源を入れて，MetaMorphを立ち上げる。
(9) 細胞の透過像（ターレットを４に合わせる），EGFPの蛍光像（ターレットは２。観察用光源のフィルターを押し込む），DsRedの蛍光像（ターレットは３。観察用光源のフィルターは手前側）を観察し，CCDカメラで画像を取り込む。

HeLa細胞の微分干渉像	DsRedの蛍光像
EGFPの蛍光像	siRNAでEGFPの発現を抑制した

データ処理

(10) 取り込んだ画像をEGFP、DsRedともディスプレイ上の左のバーを使って擬似カラーをつけ、auto threshhold light object をクリックし、蛍光の範囲を選択する。
(11) measureのintegrated morphometry analysisをクリックし、setup parameterのmeasuringを選択し、measureをクリックする。
(12) (11) の操作で、蛍光エリアのトータル面積がわかるので、EGFPとDsRedそれぞれの蛍光エリアのトータル面 積を求め、EGFP／DsRedで各々のサンプルの比を求める。

参考文献